上清液とケロイド★★ロート★★Human Adipose-derived Stem Cells Induce Cell Senescence in a Keloid Model

Keloid disorder is primarily characterized by　unremitting accumulation of collagen fiber. An　effective treatment method and the underlying mechanism needs to be explored. In this study, human adipose-derived stem cells (ADSCs) were cultured with
either keloid or normal fibroblasts in vitro. For in vivo study, keloid fibroblasts were seeded on a honeycomb collagen sponge, which was implanted for 8 weeks in
severely immunodeficient (NOD/SCID) mice (KFgroup). ADSCs were then locally administered in this model (KF-ADSC group), and the effect on keloid fibroblasts was immunohistochemically investigated.
The in vitro study demonstrated that transforming growth factor (TGF)-β and collagen production decreased during incubation and the number of SA-β-galactosidase+ cells increased in keloid fibroblasts by ADSCs. The in vivo study revealed that the numbers of α-SMA+, CD26+, PCNA+ cells, the sum intensity of TGF-β+, and collagen production
were significantly reduced in KF-ADSC compared with those in KF (P<0.01). Unlike KF, positive responses to p16INK 4a and tumor necrosis factor (TNF)-α were found in myofibroblasts/fibroblasts of the KF-ADSC groups, indicative of cell senescence in
keloid fibroblasts by ADSCs (P<0.01). These results indicate that ADSCs inhibited cell proliferation and collagen production of keloid fibroblasts in vitro and in vivo, possibly through cell senescence.
Key words: keloid, fibroblast, myofibroblast,adipose-derived stem cell, senescence
Key messages: The underlying mechanism and an effective treatment need to be explored in keloid. The aim of this study is to search for a potential role of
adipose-derived stem cell (ADSCs) in inhibiting keloid formation in vitro and in vivo. 72 severely immunodeficient mice were used for in vivo study.
Positive responses to SA-β-galactosidase and p16 INK 4a were found in the keloid fibroblasts treated with ADCSs, indicating that ADSCs inhibited cell proliferation and collagen production of keloid fibroblasts in vitro and in vivo, possibly through cell
senescence.

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ケロイド疾患は、主にコラーゲン繊維の絶え間ない蓄積を特徴とする。
効果的な治療法とその根本的メカニズムを探る必要がある。本研究では、ヒト脂肪由来幹細胞（ADSC）をケロイドまたは正常線維芽細胞とともにin vitroで培養した。in vivo研究では、ケロイド線維芽細胞をハニカムコラーゲンスポンジに播種し、 重度免疫不全（NOD/SCID）マウス（KF群）に8週間移植した 。次に、ADSCをこのモデル（KF-ADSC群）に局所投与し 、ケロイド線維芽細胞に対する効果を 免疫組織化学的に調べた。in vitro研究では、ADSCによって培養中に形質転換 成長因子（TGF）-βとコラーゲン産生が減少し、 ケロイド線維芽細胞中のSA-β-ガラクトシダーゼ+細胞 数が増加することが実証さ れた。生体内研究では、 α-SMA+、CD26+、PCNA+細胞の数、 TGF-β+の合計強度、コラーゲン産生がKFと 比較してKF-ADSCで有意に減少したことが明らかになった（P<0.01）。KFとは異なり、 p16INK 4aおよび腫瘍壊死因子に対する 陽性反応はKFでは見られなかった。

KF-ADSC グループの筋線維芽細胞/線維芽細胞で TNF-α が見つかり、ADSC によるケロイド線維芽細胞の細胞老化が示唆されました (P<0.01)。これらの結果は、ADSC がおそらく細胞老化を介して 、in vitro および in vivo でケロイド線維芽細胞の細胞増殖とコラーゲン生成を阻害したことを示しています。 キーワード: ケロイド、線維芽細胞、筋線維芽細胞、 脂肪由来幹細胞、老化 重要なメッセージ: ケロイドでは、根本的なメカニズムと 効果的な治療法を調査する必要があります。この研究の目的は、in vitro および in vivo でケロイド形成を阻害する脂肪由来幹細胞 (ADSC) の潜在的な役割を探索することです 。in vivo 研究では、72 匹の重度 免疫不全マウスを使用しました。 ADCS で処理したケロイド線維芽細胞では SA-β-ガラクトシダーゼと p16 INK 4a に対する陽性反応が 見られ 、ADSC が おそらく細胞老化を介して、in vitro および in vivo で ケロイド線維芽細胞の細胞増殖とコラーゲン生成を阻害したことを示しています 。

 

 

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Discussion
While the importance of an in vivo animal model is obvious, there is a limitation to the use of any model by

implanting human keloid tissue fragments or cells. An
approach to develop an in vivo mouse keloid model has
recently been introduced as an important adjunct to
advance keloid research, with cultured keloid
fibroblasts being seeded alone or with keratinocytes on
a biodegradable scaffold such as collagen14 and fibrin
gel.15 In this study, a simple and reliable ex vivo model
of keloids previously established by seeding human
keloid fibroblasts on a collagen sponges with a
honeycomb structure was introduced to form keloids16,
which were implanted in NOD/SCID mice. In NOD/
SCID mice, diabetes that develops in NOD mice was
not observed due to the lack of T and B cells.
Furthermore, it is possible to conduct research to
elucidate the pathogenic mechanism of keloids since
NK activity is reduced.
The characteristic findings of keloids include
increased fibroblast proliferation17, increased ECM
synthesis18 (increased levels of type I19/III20 collagen)
combined with reduced ECM degradation21, reduced
apoptosis7
, and defective senescence10 in keloidogenesis. Previous keloid studies demonstrated that increased
numbers of α-SMA+ myofibroblasts and fibroblasts,
which were mediated by elevated levels of TGF-β and
IL-6, resided in keloids.22-25 It has been recently
reported that CD26 is involved in collagen production
of fibroblasts.26 Additionally, expression of CD26 is
reported to promote during keloid progression.17, 27
The present study demonstrated significant increase in
the number of positive cells for human specific α-SMA
and CD26, and in the intensity level of TGF-β and
ECM synthesis (increased levels of human specific
type I/ III collagen) in the cell-honeycomb sponge
composite 8 weeks after implantation (Fig. 3 and 4,
P<0.01). These findings were consistent with previous
reports17, 22-27 and confirmed that keloid sphere was
developed from cell-honeycomb sponge composites.
Keloid model using NOD/SCID mice was thus
considered appropriate as a simple and reliable in vivo
model.
In this study, we focused our attention on the effect
of ADSCs on keloid fibroblasts. Based on our results,
the expression of cell markers (α-SMA, CD26, and
TGF-β) in keloid fibroblasts was found markedly
lower in the ADSC-treated groups (KF-ADSC 2 and 4)
than in KF, and the degree of this reduction was
proportional to the frequency of ADSC administration
(Fig. 3B and 4A, P<0.01). With ADSC administration,
excessive collagen deposition, particularly with type
III collagen accumulation in the peripheral region of
transplant, was effectively inhibited (Fig. 4B and C,
P<0.01), suggesting that ADSCs modulate the process
of collagen production in keloid fibroblasts. To clarify

the underlying mechanisms, cell proliferation (PCNA),
the involvement of cell senescence (p16 INK 4a), collagen
degradation (MMP-13), and apoptosis (caspase-3)
were further investigated. The results showed that
collagen degradation and apoptosis did not play a role
in the adequate modulation by ADSCs (Fig. 5). On the
other hand, cell proliferation significantly decreased
and positive responses to p16 INK 4a was observed at
a higher frequency of ADSC administration (Fig. 5
and 6, P<0.01). Double and triple-labeling
immunohistochemistry study showed that the number
of α-SMA+/p16INK 4a + and α-SMA+/p16INK 4a +/
TNF-α+ cells increased in proportion to the frequency
of ADSC administration (Fig. 6). Taken together with
the in vitro data on TGF-β/collagen production and
SA-β-galactosidase activity, this study provides
evidence that ADSCs mediate and induce cell
senescence in keloid fibroblasts.
Senescent cells, unlike quiescent cells, do not
resume the cell cycle under any physiological stimulus.
Additionaly, senescent cells are known to secrete a
number of factors including proteases such as matrix
metalloproteases and proinflammatory cytokines such
as senescence-associated TNF-α, which affect the
tissue microenvironment and their surrounding cells.28
The amount and activity of lysosomes in senescent
cells change, which is reflected in the increased
β-galactosidase activity as the metabolic characteristics.
In the absence of cell senescence, increased collagen
deposition and enhanced fibrosis were previously
demonstrated by defective senescence model mice
such as CCN1mutant mice (unable to induce p16- and
p53-mediated senescence) and p16-3MR reporter
senescence model mice (deprived of senescent
cells).29, 30
Clinically, autologous fat grafting procedure has
been employed as a treatment for keloids since the
1980s.31 It has been shown not entirely effective, since
the gold standard technique to harvest the subcutaneous
tissue is by the conventional liposuction, which is a
very traumatic procedure damaging the collected
adipose tissue and modifying the healing and
regenerative capability, though some investigators
found it enhanced tissue regeneration with better
quality of scars in burn patients with keloids.32, 33
Besides, these grafts are known to contain ADSCs
whose inherent properties have the ability to facilitate
soft tissue maturation and scar remodeling.34, 35 Though
ADSCs have been explored as a potentially valuable
adjunct therapy for burn patients with keloids, the
underlying mechanisms are not clearly elucidated and
consistent scientific evidence is still needed to
recommend its clinical use.

The present study established an indirect co-culture
system of ADSCs and keloid fibroblasts using a
Transwell chamber in vitro, wherein ADSCs were not
in direct contact with fibroblasts. Contrary to this,
ADSCs were in direct contact with keloid fibroblasts in
in vivo experiment. Therefore, the interaction between
the two cell types could be achieved through the
influence of receptors in addition to their direct
interaction. As a result, we observed that ADSCs
effectively inhibited excessive cell proliferation and
collagen synthesis through cell senescence which was
mediated by senescence-related TNF-α. The ADSC
transplant may include exosomes that modify the
recipient keloid fibroblasts through the microRNA
which creates signaling waves and initiates the
adequate healing and regenerative response, thereby
suggesting that ADSCs may induce cell senescence in
keloid fibroblasts and myofibroblasts and play an
important role to attenuate biological activity of keloid
disorder.36
In conclusion, keloid fibroblasts became senescent
when treated with ADSCs, which acted as an inhibitor
in the regulation of fibroblast proliferation and collagen
production. It is due to a modulation of the healing and
regenerative synchronized response by the ADSC
transplant which finally result in an adequate scar and
regenerated native tissue. Though a novel therapeutic
approach using stem cells is promising for the
management of keloids, these findings were merely
observed in a limited murine keloid model with a
ADSC xenograft. Seeding ADSCs on biodegradable
nanofiber sheet to insert underneath intractable severe
keloids is one of the strategies to bring ADSC transplant
to actual clinical application for individuals. Further
studies are needed to search for a potential role of
ADSCs in inhibiting keloid formation.
Acknowledgments
The author expresses his sincere gratitude to the ROHTO
Pharmaceutical Co., Ltd., Kyoto, Japan for its kind donation of
the adipose-derived stem cells used in the present study. The
author is also grateful to the staff at the Kindai Life Science
Research Institute for dedicated animal care, maintenance, and
technical support. This study was funded in part by a grant
from Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. The funder had no role
in the study design, data collection and analysis, decision to
publish, or preparation of the manuscript.

 

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議論
生体内動物モデルの重要性は明らかであるが、モデルの使用には限界がある。

ケロイドは、ヒトのケロイド組織片や細胞を移植することで形成される。 培養されたケロイド 線維芽細胞を、 コラーゲン14やフィブリンゲル15などの生分解性スキャフォールド上に、単独またはケラチノサイトとともに播種し、マウスの生体内ケロイドモデルを開発するアプローチは、ケロイド研究を進める上で重要な補助手段として最近導入された。本研究では、ハニカム構造 のコラーゲンスポンジ上に ヒトケロイド線維芽細胞を播種してケロイドを形成し、NOD/SCIDマウスに移植することで以前に確立された シンプルで信頼性の高いケロイドの生体外モデル を導入した 。NOD/SCIDマウスでは、 T細胞とB細胞の欠如により、 NODマウスで発症する糖尿病は観察されなかった。また、 NK活性が低下している ことから、ケロイドの発症メカニズムを解明する 研究が可能となる。 ケロイドの特徴的な所見としては、 線維芽細胞の増殖の増加17、ECM 合成の増加18（I型19/III型20コラーゲンの増加） とECM分解の減少21、 アポトーシスの減少7 、およびケロイド形成における老化の欠陥10などが挙げられます。これまでのケロイド研究では、ケロイド中に α-SMA+ 筋線維芽細胞および線維芽細胞が増加していることが示されており、 これは TGF-β および IL-6 レベルの上昇によって媒介されています 。22-25 最近、 CD26 が線維芽細胞のコラーゲン産生に関与していることが報告されています 。26 さらに、CD26 の発現は ケロイドの進行中に促進されると報告されています。17, 27 本研究では、移植後 8 週間で、細胞-ハニカム スポンジ複合体におけるヒト特異的 α-SMA および CD26 陽性細胞数、および TGF-β および ECM 合成 の強度レベル（ヒト特異的 I/ III 型コラーゲンのレベルの増加）の有意な増加が示されました （図 3 および 4、 P < 0.01）。これらの結果は、以前の 報告 17, 22-27 と一致しており、ケロイド球が細胞-ハニカム スポンジ複合体から開発されたことを確認しました 。 NOD/SCIDマウスを用いたケロイドモデルは、 シンプルで信頼性の高い生体内 モデルとして適切であると考えられた。 本研究では、ケロイド線維芽細胞に対するADSCの効果に注目した 。結果によると、ケロイド線維芽細胞における 細胞マーカー（α-SMA、CD26、および TGF-β）の発現は、 ADSC投与群（KF-ADSC 2および4）では KFよりも著しく低く、この低下の程度は ADSC投与頻度に比例していた。

（図3Bおよび4A、P<0.01）。ADSC投与により、過剰なコラーゲン沈着、特に移植片の周辺領域におけるIII型コラーゲンの蓄積が効果的に抑制され（図4BおよびC、 P<0.01）、ADSCが ケロイド線維芽細胞におけるコラーゲン産生のプロセスを調節することを示唆している。

基礎となるメカニズム、細胞増殖（PCNA）、細胞老化（p16 INK 4a）、コラーゲン分解（MMP-13）、およびアポトーシス（カスパーゼ-3）の関与についてさらに調査しました。結果は、コラーゲン分解とアポトーシスは ADSCによる適切な調節に役割を果たしていないことを示しました（図5）。 一方、ADSCの投与頻度が高いほど、細胞増殖は大幅に減少し 、p16 INK 4aに対する陽性反応が観察されました （図5 および6、P<0.01）。二重標識および三重標識免疫組織化学研究により 、α-SMA + / p16INK 4a +およびα-SMA + / p16INK 4a + / TNF-α +細胞の 数はADSCの投与 頻度に比例して増加することが示されました （図6）。 TGF-β/コラーゲン産生および SA-β-ガラクトシダーゼ活性 に関するin vitroデータと合わせて、この研究は、ADSCが ケロイド線維芽細胞における 細胞老化を媒介および誘発するという証拠を示しています。 老化細胞は、静止細胞とは異なり、 いかなる生理的刺激を受けても細胞周期を再開しません。 さらに、老化細胞は、 マトリックスメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼ や老化関連TNF-αなどの炎症性サイトカインを含む多くの因子を分泌することが知られており、これらは 組織の微小環境および周囲の細胞に 影響を及ぼします。28 老化細胞のリソソームの量と活性は 変化し、それが代謝特性としてβ-ガラクトシダーゼ活性の増加に反映されます 。 細胞老化がない場合、コラーゲン 沈着の増加と線維化の促進は、 CCN1変異マウス（p16および p53を介した老化を誘導できない）やp16-3MRレポーター 老化モデルマウス（老化細胞がない）などの 欠陥老化モデルマウスによって以前に実証されています 。29, 30 臨床的には、自己脂肪移植手順は 1980年代 からケロイドの治療に使用されています。31 皮下組織を採取するゴールドスタンダード技術は 従来の脂肪吸引であり、これは 非常に外傷的な手順であり、採取した 脂肪組織を損傷し、治癒および 再生能力を変化させるため、完全に効果的ではないことが示されていますが、一部の研究者は、ケロイドのある火傷患者の組織再生を促進し、瘢痕の質を向上さ せることを 発見しました 。32, 33 さらに、これらの移植片には、軟部組織の成熟と瘢痕のリモデリングを促進する。34, 35ADSC はケロイドを伴う火傷患者に対する潜在的に価値のある補助療法として研究されてきたが、その根底にあるメカニズムは明確に解明されておらず、 臨床使用を推奨するには一貫した科学的証拠がまだ必要である。

本研究では、トランスウェルチャンバーを用いて、ADSCとケロイド線維芽細胞の間接共培養システムをin vitroで確立しました。このシステムでは、ADSCは線維芽細胞と直接接触していません。これとは対照的に、 in vivo実験では、ADSCはケロイド線維芽細胞と直接接触しています。したがって、2つの細胞タイプの相互作用は 、直接的な相互作用に加えて、受容体の影響を通じて達成できます。その結果、ADSCは 、老化関連のTNF-αによって媒介される細胞老化を通じて 、過剰な細胞増殖と コラーゲン合成を効果的に阻害する ことが観察されました。

ADSC 移植には、 シグナル波を生成し、 適切な治癒および再生反応を開始する マイクロ RNA を介してレシピエントのケロイド線維芽細胞を変更するエクソソームが含まれる可能性があり、それによって ADSC が ケロイド線維芽細胞および筋線維芽細胞 の細胞老化を誘発し、ケロイド 障害 の生物学的活動を減弱させる重要な役割を果たす可能性があることを示唆 しています。36 結論として、ケロイド線維芽細胞は ADSC で処理すると老化し、 線維芽細胞の増殖およびコラーゲン生成の調節において阻害剤として作用しました。これは 、ADSC 移植による 治癒および再生の同期反応の調整によるもので 、最終的に適切な瘢痕と 再生された天然組織をもたらします。 幹細胞を使用する新しい治療法はケロイドの管理に有望です が、これらの知見はADSC 異種移植 による限られたマウスケロイドモデルでのみ観察されました 。生分解性 ナノファイバーシート上に ADSC を播種し、難治性の重度 ケロイドの下に挿入することは、ADSC 移植を 実際の臨床応用に持ち込む戦略の 1 つです。 ケロイド形成を阻害する ADSC の潜在的な役割を探索するには、さらなる研究が必要です。 謝辞 本研究で使用した脂肪由来幹細胞 を提供してくださった京都のロート製薬株式会社 に心より感謝の意を表します。また 、献身的な動物の世話、維持、技術サポートをしてくださった 近大生命科学研究所のスタッフにも感謝します。本研究は 、ロート製薬株式会社からの 助成金によって部分的に資金提供されました。資金提供者は 、研究デザイン、データ収集と分析、 出版の決定、または原稿の準備には一切関与していません。